Az Assassin's Creed: Brotherhood-ban Ezio Rómába megy, hogy a csapatával megtámadja a korrupt Templomosokat. Ezio arzenáljából most sem hiányozhat a tőr - akár kettő egyszerre, a méreggel teli fecskendő vagy a fejsze.

Először a sorozatban megjelenik a Multiplayer mód, amelyben akár a templomosok bőrébe is bújhatsz, vagy Abstergben kiképezheted Magad profi bérgyilkossá saját gyilkolási módszerrel. 

Multiplayer mód:

• Leonardo da Vinci, Machiavelli vagy akár Caterine Sforza segítsége
  
• Új fegyverek, mint a méreggel töltött fecskendő, fejsze vagy akár két tőr egyszerre
  
• A saját bérgyilkosaidat Abstergben toborozhatod